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Enzymologie et unités (vers 2006 ?)

Retrouvez ci-dessous des échanges autour des unités utilisées en enzymologie.

Bénédicte :

En étudiant les cours d'enzymologie, les sujets d'exercices et même les sujets de bac, nous nous sommes rendus compte que les définitions en enzymologie ne sont pas toujours claires, ou pas forcément respectées. Par exemple, on trouve des Vi exprimées en variation de concentration par unité de temps, ou en variation de quantité par unité de temps... Troublant, non ? Personnellement, j'utilise les définitions suivantes : * une vitesse * est une variation de concentration (du substrat ou du produit) par unité de temps dans le milieu réactionnel ; elle s'exprime généralement en U/L de milieu réactionnel ou en Katal/L de milieu réactionnel. *une concentration d'activité catalytique* est une variation de concentration par unité de temps rapportée au volume de solution enzymatique ; elle s'exprime en U/L de solution enzymatique (sérum...) ou en katal/L de solution enzymatique. *une activité* est une variation de quantité par unité de temps dans le mélange réactionnel étudié ; je l'exprime en U ou en katal. est-ce qu'on peut confronter nos idées à ce sujet ? Merci d'éclairer nos lanternes !

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Jean-Pierre :

A propos des unités de la vitesse des réactions enzymatiques. Considérons une réaction au cours de laquelle un substrat S est transformé en un produit P par une enzyme E. Mélangeons au temps zéro E et S. La vitesse v de la réaction sera donnée par la variation de S ou de P en fonction du temps. Variation de quoi? Tout dépend de S et P...

1- Les concentrations en S ou P peuvent être exprimées en moles. On peut alors écrire v = d[S]/dt = d[P]/dt. La vitesse est ici une variation de concentration (dans le milieu réactionnel) par unité de temps. Dans le système international d'unités, v s'exprimera donc en mol/L de MR/s. Mais une variation du nombre de moles ou d'absorbance par unité de temps reflète tout aussi bien cette vitesse. Dans un exercice, il me semble que le plus pertinent est de donner les unités dans lesquelles on attend la réponse de l'élève. Pour ma part, je leur demande de faire l'effort d'utiliser les unités du SI tant qu'il n'y a pas d'indication différente dans l'énoncé. Mais de telles unités ne sont pas toujours utilisables. 2- Les concentrations en S ou P ne peuvent pas être exprimées en moles. C'est le cas pour de nombreuses hydrolases agissant par exemple sur l'amidon, les protéines, l'ADN ou encore le peptidoglycane. Les vitesses d'action de l'amylase, des protéases, des DNAses ou du lysozyme ne peuvent donc pas s'exprimer en moles/L/s. D'autres unités sont alors retenues (variation de trouble, d'absorbance, d'acidité... par unité de temps). Ces unités sont alors naturellement indiqués dans l'énoncé. S'il me paraît donc pertinent d'exprimer, lorsque c'est possible, une vitesse de réaction en mole de substrat transformé (ou de produit formé) par seconde et par litre de milieu réactionnel, il ne me paraît par contre pas du tout indiqué d'exprimer une vitesse en U ou en Katal/L de milieu réactionnel car il y a des différences fondamentales entre une U et une µmole par minute ou entre un katal et une mole par seconde. Retour sur les définitions des unités d'activité.

Un katal est la quantité d'enzyme qui transforme une mole de substrat par seconde dans des conditions opératoires parfaitement définies (unité du système SI). Une unité internationale U (une UI si vous voulez mais c'est trop long…) est la quantité d'enzyme qui transforme une µmole de substrat par minute dans des conditions opératoires parfaitement définies (unité antérieure au katal, toujours en usage, dans les catalogues commerciaux par exemple). Ces deux unités ne sont d'ailleurs pas universelles car il est des cas où S et P ne sont quantifiables par des moles (cf ci-dessus)… D'autres unités, appelées souvent d'ailleurs également U, sont alors à définir (une unité U de lysozyme peut par exemple être la quantité d'enzyme qui provoque une variation du trouble d'une suspension de micrococcus Lysodeikticus de 0.001 par minute à 450 nm dans des conditions opératoires bien définies: nature, concentration et pH du tampon et autres additifs éventuels, concentration en substrat, température, longueur du trajet optique. Signification de U/L ou Katal/L. Raisonnons avec des U. Dire que dans un milieu réactionnel il y a n U par L signifie qu'un litre de ce milieu réactionnel contient n unités U, c'est-à-dire n fois la quantité d'enzyme qui pourrait, dans des conditions expérimentales bien déterminées (celle de la définition de l'unité), transformer une µmole de S par minute après mélange de S et E au temps O. Mais ces n U par litre ne reflètent en rien la vitesse initiale obtenue réellement dans un milieu réactionnel quelconque: tout dépend les conditions qu'y trouve l'enzyme… Introduisons par exemple une même quantité d'enzyme dans trois tubes contenant la même quantité d'une solution de substrat tamponné préincubés l'un à 5, l'autre à 30 et le dernier à 50°C. Il y a fort à parier que les vitesses initiales seront différentes (les µmoles/L de MR/min seront différentes) alors que les concentrations en enzymes dans ces tubes, les U/L, sont identiques… Pour redire encore une fois les mêmes choses, mole/L de MR/s est bonne unité de vitesse initiale de réaction (bien que pas toujours utilisable) alors que katal / L de milieu réactionnel est une unité de la concentration en enzyme de ce milieu. Ce n'est donc pas une unité de vitesse. Je pense qu'il faut apprendre aux étudiants à passer de la vitesse mesurée (ou calculée) à la quantité d'enzyme qui est responsable de ce "travail" Passer des vitesses aux quantités d'enzymes. Lorsqu'on a trouvé le nombre de moles de substrat transformées par litre de milieu réactionnel et par seconde, il est facile d'en déduire le nombre de moles de substrat transformées non pas dans un litre mais dans le vrai milieu réactionnel puis d'en déduire, à condition que les conditions prévues dans la définition de l'unité aient été respectées, la quantité d'enzyme présente dans ce même milieu. Calculs. Soit une réaction S donne P au cours de laquelle on peut mesurer l'absorbance A du produit. La démarche sera par exemple :

1- Mesure de l'absorbance AML du produit dans un milieu de lecture ML de volume VML. 2- Calcul de la concentration en produit dans ce même milieu de lecture (CML = A/epsilon l). 3- Calcul de concentration en produit dans le milieu réactionnel(CMR = CML * VML/VMR). 4- Calcul de la vitesse initiale vi (en mol/L de MR/s) = CMR / t. 5- Calcul du nombre n de moles de S transformées par seconde dans le MR = vi * VMR (moles par seconde). 6- Calcul de la quantité d'enzyme (en katals) dans le MR (= activité enzymatique du MR = AEMR = vi * VMR katals ici (la concentation en enzyme dans le MR n'a que peu d'intérêt mais présente l'inconvénient de pouvoir être confondue avec la concentration catatytique elle aussi exprimée en kat/L…). 7- Calcul de l'activité volumique (ou concentration d'activité ou concentration en enzyme) ou concentration d'activité catalytique en katal par litre d'enzyme (AV = CAC = AEMR / VE (kat/LE), VE étant le volume d'enzyme introduit dans le milieu réactionnel).

Une écriture linéaire du type : AV (kat/L) = AML.1/(eps.l).VML.1/VMR.1/t.VMR.1/VE Permet - de bien monter la démarche suivie, - d'éviter de mystérieux "facteurs de dilution", sources de bien d'erreurs; - de bien vérifier l'homogénéité : moles par litre par seconde jusqu'à 1/t, katals après le deuxième VMR…. - de bien positionner le passage de la vitesse (en moles/L/s) à la quantité d'enzyme (exprimée en katal) qui en est responsable; - de montrer que des kat/L sont finalement égaux à des kat/L et non à des mol/L/s… - de montrer également que le calcul de vi est inutile dans un calcul de CAC (diviser par VMR pour multiplier ensuite par VMR)…

[En étudiant les cours d'enzymologie, les sujets d'exercices et même les sujets de bac, nous nous sommes rendus compte que les définitions en enzymologie ne sont pas toujours claires, ou pas forcément respectées. Par exemple, on trouve des Vi exprimées en variation de concentration par unité de temps, ou en variation de quantité par unité de temps... Troublant, non ? ] Troublant, certes, mais je pense qu'il faut habituer les étudiants à cette diversité tout en leur précisant les unités (ou le système d'unités…) qu'ils doivent utiliser dans tel ou tel exercice. Personnellement, j'utilise les définitions suivantes : * une vitesse* est une variation de concentration (du substrat ou du produit) par unité de temps dans le milieu réactionnel ; elle s'exprime généralement en U/L de milieu réactionnel ou en Katal/L de milieu réactionnel. Tu auras compris que si je partage de début, je pense qu'il faut absolument éviter la fin qui n'est pas une expression de la vitesse mais de la concentration en enzyme dans le milieu réactionnel. - *une concentration d'activité catalytique* est une variation de concentration par unité de temps rapportée au volume de solution enzymatique ; elle s'exprime en U/L de solution enzymatique (sérum...) ou en katal/L de solution enzymatique. Je ne partage évidemment pas cette affirmation car une concentration d'activité n'est pas une "vitesse" ramenée à un L de solution enzymatique, mais la quantité d'enzyme présente dans un litre de solution enzymatique. - _*une activité*_ est une variation de quantité par unité de temps dans le mélange réactionnel étudié ; je l'exprime en U ou en katal. Et tout ce différend finalement parce qu'on n'utilise pas la même définition de "l'activité" : pour toi c'est une vitesse (une variation de quantité par unité de temps), pour moi c'est une quantité d'enzyme…. Cette quantité d'enzyme peut se trouver d'ailleurs dans le MR (AE du MR), dans 1 L de solution d'enzyme (AV ou CAC), dans un g de protéines (AS) ou même dans une mole d'enzyme (AM). Noter que dans les trois dernières quantités (mole, gramme ou litre), la vitesse est nulle… mais pas la quantité d'enzyme présente…. Merci à nos collègues d'éclairer nos lanternes ! Désolé d'avoir été si long…

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Jean :

Bonjour, J'adhère à vos définitions. Il est cependant classique de dire: - un "dosage" d'enzyme consiste à déterminer l'activité catalytique d'une préparation; - Activité = Vmax dans des conditions définies. Cela conduit à une incohérence. Si l'activité est une vitesse de réaction, elle est une variation de concentration par unité de temps: - son unité ne peut être que U/L ou kat/L; - U et kat ne peuvent être des unités d'activité; - catc n'a pas de sens. Dans l'état actuel des choses, on ne peut que faire avec cette ambiguïté. Une clarification serait cependant bienvenue. Il faudrait : - ne plus dire : activité = Vmax; - demander en clair le nombre de µmol de produit apparu par unité de temps si l'on veut connaître une variation de quantité par unité de temps. Mais sans doute y a-t-il d'autres points de vue. Jean

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Véronique :

En chimie, une vitesse peut être exprimée en variation de quantité par unité de temps et une variation de concentration dans le milieu réactionnel par unité de temps est appelée vitesse volumique. Il est indispensable de préciser aux élèves ce que l'on attend.

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Jean :

Je dois apporter une correction à mon mail précédent dans lequel je distinguais 2 versions de l'activité enzymatique. Version 1 : activité = Vmax ou vitesse dans système défini Version 2 : activité = quantité d'enzyme. Mon erreur porte sur la version attribuée au livre "Activités technologiques en Biochimie. Fasquel et Dumon". Dans la 1ère édition du tome 1 : version 1 (page 73) Dans la 2ème édition du tome 1 : version 2 (page 69). La 2ème édition de cet ouvrage distingue : - une vitesse de conversion du substrat (variation de quantité par unité de temps); - une vitesse de réaction (variation de concentration dans le milieu réactionnel). Le cours de Didier Hirou, que je consulte souvent sur internet, présente la version 2 (TSTL : enzymologie : ce qu'il faut savoir): page 2 : "Vmax représente l'activité catalytique de l'enzyme". "L'activité catalytique est mesurée par la vitesse de la réaction...." page 3. D'après le petit historique présenté par Didier Hirou, la version 1 (activité mesurée par la vitesse) aurait été adoptée en 1978. La version 2 (qui entraîne U = quantité) remonterait à 1961 et 1966. En espérant ne pas avoir trahi les auteurs et en leur présentant mes excuses si c'était le cas. Amicalement )

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Jean :

Bonsoir, J'ai lu avec beaucoup d'intérêt la présentation de Jean-Pierre. Il y a deux versions de l'activité enzymatique. Version 1 (Activités technologiques en biochimie (Fasquel. Dumon); CRDP Bordeaux) Vmax représente l'activité de l'enzyme dans des conditions expérimentales bien définies. On l'exprime en U, c'est-à-dire en µmoles de substrat transformé par min ou en kat. Version 2 (qui est celle présentée par J.P.Péré): l'activité est une quantité d'enzyme. Dans mon mail précédent, je faisais une objection à la version 1 qui conduit à une incohérence entre Vmax et ses unités si l'on définit la vitesse comme une variation de concentration par unité de temps. Cette objection disparaît si on se rallie aux définitions données par notre collègue Véronique qui distingue: - la vitesse : variation de quantité par unité de temps; - la vitesse volumique : variation de concentration par unité de temps.

L'objection que l'on peut faire à la version 2 est que, s'il est naturel dans le langage courant d'associer une activité et une vitesse, il n'est pas évident par contre d'assimiler une activité et une quantité. Cela pourrait conduire à dire notamment que la quantité d'enzyme contenue dans 1 mg d'enzyme n'est pas la même à 25°C et à 37°C.

N'enseignant qu'en terminale STL, mon approche n'est qu'opérationnelle. Voici une proposition pour répondre à Bénédicte dans le cadre qui est le mien: - La vitesse de réaction est la variation de quantité de substrat ou de produit par unité de temps dans le milieu réactionnel. - La vitesse de réaction volumique est la variation de concentration de substrat ou de produit par unité de temps dans le mileu réactionnel. - Vmax est la vitesse de réaction maximale dans le milieu réactionnel dans des conditions bien définies; elle s'exprime en U ou en kat. Vmax est l'activité de l'enzyme. - la concentration d'activité catalytique est égale à l'activité divisée par le volume de préparation enzymatique introduit dans le milieu réactionnel. Elle s'exprime en U ou kat par litre de préparation enzymatique.

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Philippe :

Pour ma part, l'UI n'existe pas (ou plus ?). Je considère la µmol/min comme un exemple d'unité parmi d'autres (Cf. lysozyme) et je préfère parler d'UE (unité d'enzyme) pour insister sur le fait qu'il s'agit d'un dosage d'activité d'enzyme, et qu'il faut donc en préciser systématiquement le contexte (bref, définir l'UE en question).

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Valérie :

Suite aux demandes des élèves d'avoir quelques définitions claires j'ai essayé de récapituler les différentes notions en tenant compte des remarques formulées par les collègues. Comme je ne suis pas spécialiste en enzymologie, j'ai peur d'avoir fait des erreurs. Merci aux collègues pour leurs exposés détaillés ainsi que pour leurs futurs remarques.

Définitions en enzymologie

La vitesse initiale Vi d'une réaction enzymatique peut être exprimée en variation de concentration par unité de temps (vitesse volumique) ou en variation de quantité par unité de temps.

- L' activité enzymatique ou catalytique (AC) == quantité de substrat transformé par unité de temps dans le milieu réactionnel exprimée en UI ou katal (quantité d'enzyme dans la cuve). § si Vi est exprimée en variation de quantité par unité de temps, la détermination de Vmax sur la courbe correspondante (Vi == f [S]) correspond à l'activité enzymatique § si Vi est exprimée en variation de concentration par unité de temps, on déterminera l'activité catalytique de la manière suivante:

AC == Vmax (mol/L/s)* Vmr (L) (volume dans le milieu réactionnel)

- L’activité spécifique ( AS ) est la quantité de substrat transformée par unité de temps et par masse d'enzyme == l’activité enzymatique ramenée à une masse d’enzyme, elle est donc exprimée en UI . mg –1 d'enzyme ou en katal.g-1 d’enzyme.

AS == AC/ mE mE == masse d'enzyme en g

- L’activité enzymatique molaire ( AES ) ou activité molaire spécifique ( AMS ) est la quantité de substrat transformé par unité de temps et par mole d'enzyme == l’activité enzymatique ramenée à une = mole d’enzyme, elle est donc exprimée en UI . mole –1 d’e=nzyme ou en katal . mole-1 d'enzyme.

AMS == AS* ME ME == masse molaire de l'enzyme en g.mol-1

- La concentration d’activité catalytique ( Catc ) est la quantité de substrat transformé par unité de temps et par litre de solution d'enzyme == l’activité enzymatique ramenée à un volume de milieu réactionnel, elle est donc exprimée en katal . L-1 d'enzyme ou en UI . L-1 d'enzyme.

Catc == AC / EE EE == prise d'essai d'enzyme en L

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Jean-Pierre :

Il est indispensable de pousser bcp plus loin cette discussion sur les définitions en enzymologie. La liste upbm est un outil précieux, ouvert et tolérant que nous nous sommes donnés. Servons-nous en!

Voici une autre contribution de ma part. Je voulais écrire 2 lignes, et puis…

Pour agir sur un substrat, une enzyme doit être "active". Si on la met dans un environnement qui permet cette "activité", elle sera susceptible d'agir sur son substrat. Cette "activité" (= action = catalyse) est quantifiable par une vitesse (en moles par s par exemple ou mieux en mole/LMR par seconde car cette deuxième grandeur ne dépend pas comme la première du volume du milieu réactionnel). L'action d'une enzyme, son "activité" peut donc se quantifier par une vitesse.

Mais l'activité est aussi une grandeur qui a différentes unités dont l'une est le katal, un katal étant la quantité d'enzyme qui transforme une mole de substrat par seconde dans des conditions opératoires parfaitement définies (qui ne conduisent d'ailleurs pas toujours à une VM...).

Si un katal est une quantité d'enzyme, ce n'est pas une vitesse.... Si une préparation enzymatique a une activité spécifique de 15 nanokatals / mg, cela signifie que dans un mg de protéines on a zéro moles de substrat transformé par s, mais on a une quantité d'enzyme qui peut transformer 15 nanomoles de substrat par seconde si la place dans les conditions expérimentales prévues dans la définition de l'unité retenue ici (qui ne correspondent pas forcement à une Vmax…). Quand je pèse 10 mg d'enzyme, et que je les mets en solution, j'ai manipulé 150 nkatals, mais 0 moles/s : il n'y a pas de réaction dans la coupelle de ma balance...

Mettez un nano katal dans un milieu réactionnel (= 1 /15 de mg). Celui-ci pourra conduire à une vitesse quelconque : nulle s'il fait trop froid, trop chaud, trop acide.., moyenne si le substrat a une sale tête, s'il faut lui courir après... ou maximale si tout va bien. Au risque de vous troubler, cette vitesse maximale obtenue avec un nanokatal d'enzyme dans le MR peut d'ailleurs être supérieure à une nanomole de substrat transformé par seconde si l'enzyme y trouve des conditions différentes de celles retenues dans la définition de l'unité: un substrat différent qu'elle transforme plus vite, une concentration plus forte en S (à condition qu'il n'y ait pas inhibition par excès de celui-ci), une température plus favorable.... Prenons conscience que la température retenue dans la définition de l'unité n'est pas la température optimale de l'enzyme, mais une température standardisée (25, 30 ou 37°C le plus souvent). Mettez un nanokatal dans les conditions de température optimale (les autres conditions prévues dans la définition de l'unité étant par ailleurs respectées) et vous obtiendrez peut être plus d'une nanomole de substrat transformé par seconde: 1.8 par exemple...

Prenons le problème à l'envers : si vous obtenez 1.8 nanomoles de substrat transformé par seconde à température optimale, vous ne pouvez pas dire que dans votre tube il y a 1.8 nanokatal d'enzyme: il y en a seulement 1 nanokatal car vous n'avez introduit qu'un nanokatal dans ce tube...

Conclusion: pour déterminer une activité enzymatique et l'exprimer en katal ou en UE (merci Philippe), il faut préciser ce qu'est l'unité retenue. Il faut ensuite faire l'effort de préparer un milieu réactionnel dans les conditions prévues dans la définition retenue. La cinétique qui reflète l'action ("l'activité") de l'enzyme permettra de calculer la quantité d'enzyme présente (son "activité" dans l'unité retenue...). Il faut faire avec cette ambiguïté dans le terme activité...

J'ai sous les yeux le catalogue Sigma à la rubrique b-galactosidase. Elle commence par la définition de l'unité : je sais ce que je vais acheter! Il est indiqué qu'une unité b-galactosidase est capable d'hydrolyser 1.0 µmole de o-nitrophényl b-D-galactoside en o-nitrophénol et D-galactose par min à pH 6.5 et 25 °C. Je note qu'ils ne me donnent ni la composition du tampon, ni sa concentration, ni la concentration en substrat…. Je vais avoir du mal à contrôler ce qu'il m'envoient…

J'en commande quand même 25 unités. J'espère qu'ils vont m'envoyer une certaine quantité d'enzyme et non 25 µmoles de p-nitrophényl a-D-galactoside par min pendant quelque temps…

Je prépare un milieu réactionnel à pH 7, avec un substrat fortement concentré (je ne vais utiliser du lactose pour ne pas compliquer…). J'introduis une unité de b-galactosidase dans ce milieu réactionnel préincubé à 30°C. Je ne vais pas avoir une micromole de produit formée par minute (pH différent, température différente et concentration en substrat peut être inadéquate). J'ai pourtant bien une unité dans mon milieu réactionnel.

Conclusion : pour faire des calculs d'activité, il faut définir une unité. Cela n'est pas toujours fait dans nos énoncés. La cinétique doit ensuite respecter les conditions prévues dans la définition de cette unité. Un calcul de VM à une autre température que celle prévue dans la définition de l'unité ne permettra pas de faire un calcul d'activité (à moins d'être capable de faire une correction de vitesse…).

Tous ce raisonnement est bâti sur la définition du katal ou de l'UE que j'utilise (quantité d'enzyme qui…). Mais peut-être a-t-on là des divergences. Mettons les au grand jour, c'est le moment de clarifier.

J'avais commencé par écrire les quelques lignes ci-dessous. Je les laisse finalement…

Qestion très sérieuse à Valérie :

Comment définis-tu le katal et l'UI?

Fais l'effort s'il te plait de répondre à cette question anodine mais fondamentale.

La grandeur qu'est "l'activité" dépend en effet de la définition qu'on retient pour l'unité dans laquelle on l'exprime...

Nos difficultés et divergences viennent de ce seul point : tant que nous ne serons pas clairs la dessus, nos étudiants seront dans le brouillard...

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Valérie :

Bonjour, Merci à tous pour vos remarques dont j'ai essayé de tenir compte pour revoir ma copie. J'espère ne pas avoir commis de nouvelles imprécisions... Par contre, je ne sais pas si la plupart des élèves de terminale STL peuvent saisir l'importance des conditions opératoires pour déterminer l'activité catalytique avec les unités choisies. On peut toujours essayer en utilisant les nombreux exemples présentés par Jean-Pierre.

Définitions en enzymologie

- La vitesse initiale Vi d'une réaction enzymatique peut être exprimée en variation de concentration par unité de temps (vitesse volumique) ou en variation de quantité par unité de temps.

- Un katal (unité du système SI) est la quantité d'enzyme qui transforme une mole de substrat par seconde dans des conditions opératoires parfaitement définies: concentration en substrat, composition du tampon, température.

- Une unité enzymatique (UE) (ou anciennement une unité internationale: UI) est la quantité d'enzyme qui transforme une µmole de substrat par minute dans des conditions opératoires parfaitement définies

- L' activité enzymatique ou catalytique (AC) est une grandeur qui peut avoir différentes unités. Celles que l'on rencontre souvent correspondent à la quantité de substrat transformé par unité de temps dans le milieu réactionnel exprimée en UE ou katal. Les conditions opératoires devant correspondre à l'unité choisie. Dans le cas d'une cinétique de type Michaelis Menten: § si Vi est exprimée en variation de quantité par unité de temps, la détermination de Vmax sur la courbe correspondante (Vi = f [S]) correspond à l'activité enzymatique § si Vi est exprimée en variation de concentration par unité de temps, on déterminera l'activité catalytique de la manière suivante:

AC = Vmax (mol/L/s)* Vmr (L) (volume dans le milieu réactionnel)

- L’activité spécifique ( AS ) est la quantité de substrat transformé par unité de temps et par masse de protéine = l’activité enzymatique ramenée à une masse de protéine ( = préparation enzymatique impure), elle est donc exprimée en UE . mg –1 de protéine ou en katal.g-1 de protéine.

AS = AC /mp mP = masse de protéine en g

- L’activité enzymatique molaire ( AES ) ou activité molaire spécifique ( AMS ) est la quantité de substrat transformé par unité de temps et par mole d'enzyme = l’activité enzymatique ramenée à une mole d’enzyme, elle est donc exprimée en UE . mole –1 d’e= nzyme ou en katal . mole-1 d'enzyme.

AMS = AS * ME ME = masse molaire de l'enzyme en g.mol-1

- La concentration d’activité catalytique ( Catc ) est la quantité de substrat transformé par unité de temps et par litre de solution d'enzyme = l’activité enzymatique ramenée à un volume de milieu réactionnel, elle est donc exprimée en katal . L-1 d'enzyme ou en UE . L-1 d'enzyme.

Catc = AC / EE EE = prise d'essai d'enzyme en L

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Jean Noël :

Petite contribution au débat, en espérant les neurones correctement connectés...

Il me semble que l'on doit distinguer activité et vitesse, même si la dimension de ces deux grandeurs est identique. Les propos de JP sont me semble-t-il très clairs sur ce point.

Je ne comprends pas l'intervention des unités dans une définition de l'activité : que l'on exprime une longueur en pied, pouce ou mètre ne change que le nombre qui l'exprime. Par contre, vu la mesure pour les enzymes, ses conditions opératoires sont importantes. On peut toutefois faire des conversions en cas de changement de température (il me semble qu'en Suisse on utilise souvent 37°C au lieu de 30°C et que les kits prévoient la conversion).

On mesure donc, à l'aide d'une vitesse dans des conditions standardisées devant être proche de Vmax, une activité, censée représenter la quantité d'enzyme, qui elle n'est pas accessible avec des méthodes simples. Cette mesure a des avantages, car elle représente bien l'efficacité catalytique d'un produit (sérum par ex) mais a des inconvénients puisqu'elle ne dose que l'enzyme active et ne distingue pas deux enzymes différentes agissant sur le même substrat (en particulier les isoenzymes). Par contre, une méthode immunologique dosera spécifiquement l'enzyme recherchée qu'elle soit ou non active. Dans le cas général, l'intérêt de doser une enzyme inactive ne me parait pas évident ! Le même problème peut se rencontrer avec le dosage des vitamines entre un dosage microbiologique (dosant les formes actives de la vitamine) et un dosage chimique ou biochimique (dosant toutes les formes réactives dans le protocole).

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Jean-Pierre :

Lorsque Jean Noël écrit "Je ne comprends pas l'intervention des unités dans une définition de l'activité" il a raison. Une longueur est par exemple "la dimension d'une chose dans le sens de sa plus grande étendue" dit le petit Robert un poids est.... Cela ne fait pas référence à l'unité de mesure. Mais faire une mesure, c'est trouver combien de fois une unité est contenue dans la grandeur à mesurer : mesurer la longueur d'un bout de bois c'est trouver combien de m (ou cm, ou...) il contient; mesurer le poids d'un panier de fruits c'est trouver combien de kg il contient; mesurer l'activité enzymatique d'une solution, c'est trouver combien d'unité elle contient (combien de katals ou de diverses UE). Pour cela on doit connaître précisément la définition de l'unité qu'on utilise. Un katal est ainsi la quantité d'enzyme qui.... une UE est la quantité d'enzyme qui... (cf mails précédents).

C'est la vitesse de réaction qui permet de trouver la quantité d'enzyme présente dans le milieu réactionnel, quantité exprimée en katals ou UE..... Pour redire ce que j'ai déjà écrit: si on mesure une absorbance, Beer Lambert permet de calculer une concentration. Si on connaît la durée de la réaction et la composition des milieux de lectures et réactionnels, on peut calculer la vitesse de la réaction enzymatique (en moles/LMR/s pe ou en moles / s dans le MR).

C'est cette vitesse qui permet de trouver la quantité d'enzyme qui a fait ce travail dans le milieu réactionnel. Une nanomole de substrat transformée par seconde dans un milieu réactionnel (préparé dans les conditions indiquées dans la définition du katal retenue) signifie que ce dernier contient un nanokatal d'enzyme. C'est là que l'enzymologie est difficile : se servir d'une vitesse pour trouver la quantité d'enzyme responsable de cette vitesse. Il me paraît fondamental de demander aux étudiants de se servir de la vitesse de réaction pour calculer la quantité d'enzyme présente dans le milieu réactionnel. Ensuite tout devient facile : si on connaît la quantité d'enzyme dans le MR, il est facile de calculer la quantité d'enzyme dans un litre de solution d'enzyme, dans un mg de protéines ou dans la totalité de la solution enzymatique. Les concentrations d'activité, les activités spécifiques et les activités totales s'expriment alors naturellement en katals (ou UE diverses) par litre, par mg ou dans la solution. Les moles par L ont disparu depuis qu'on s'est servi de la vitesse pour calculer la quantité d'enzyme dans le milieu réactionnel. Essayez donc de demander à vos étudiants de rechercher systématiquement la quantité d'enzyme présente dans le milieu réactionnel. Mais il faut pour cela que vous soyez convaincu que l'activité enzymatique est une grandeur qui s'exprime dans des unités qui sont des quantités d'enzymes capables de faire un certain travail dans des conditions très précises. J'aimerai que les interventions sur la liste s'attardent un peu là-dessus....

Si cela vous paraît bien contraignant, permettez moi de vous rappeler que faire une mesure, c'est trouver combien de fois une unité est contenue dans la grandeur à mesurer, que mesurer la longueur d'un bout de bois c'est trouver combien de m (ou cm, ou...) il contient; que depuis le 1er janvier 1963 , le mètre est la « longueur d'onde égale à 1 650 763 , 73 longueurs d'onde dans le vide de la radiation correspondant à la transition entre les niveaux 2 p10 et 5 d5 de l'atome de Krypton 86 », qu'en 1790 , il avait été défini comme la dix - millionième partie du quart du méridien terrestre. Il a aussi été défini comme étant la longueur du trajet parcouru dans le vide par la lumière pendant 1 / 299 792 458 s et enfin qu'en 1983, la Dix-septième Conférence générale des poids et mesures, considérant que (je passe) décide que : Le mètre est la longueur du trajet parcouru dans le vide par la lumière pendant une durée de 1/299 792 458 de seconde. La définition du mètre en vigueur depuis 1960, fondée sur la transition entre les niveaux 2p10 et 5d5 de l'atome de krypton 86, est abrogée. Les plus anciennes unités de mesure de longueur étaient des mesures en rapport avec des parties du corps : le pouce , le pied , le pas , l'empan , la coudée , la brasse . Conclusion; il n'y a pas que la définition de l'unité d'activité qui pose problème... En enzymologie il y a aussi plusieurs unités et il n'y aura jamais une unique unité (cf mails précédents). Si vous pensez vraiment cependant (salut, Jean...) que Vmax (= vitesse de réaction maximale dans le milieu réactionnel dans des conditions bien définies) s'exprime en U ou en kat, c'est-à-dire que Vmax est l'activité de l'enzyme, vous êtes dans une logique totalement différente. Ne soyez pas surpris alors que vos stagiaires en labo demandent régressi pour faire un lineweaver Burk pour déterminer une activité enzymatique... Jean écrivait également "l'objection que l'on peut faire à la version 2 (activité = quantité d'enzyme) est que, s'il est naturel dans le langage courant d'associer une activité et une vitesse, il n'est pas évident par contre d'assimiler une activité et une quantité". Je suis d'accord, ce n'est pas évident, mais on s'y fait... Mais lorsqu'il rajoute "cela pourrait conduire à dire notamment que la quantité d'enzyme contenue dans 1 mg d'enzyme n'est pas la même à 25°C et à 37°C" je ne suis pas d'accord. Pour savoir combien il y a d'enzyme dans un mg, il faut choisir une unité. Je choisis par exemple comme unité UE la quantité d'enzyme qui transforme une micromole de substrat par mn à 30 °C dans des conditions expérimentales bien définies (et cela me permet de répondre à un autre mail) : nature et concentration du (des?) substrat(s), nature et concentration du tampon et autres additifs, pH précis (6.83) et température fixe (30 °C par exemple), il y aura toujours la même quantité d'enzyme dans 1 mg que je le place à 10, 25, 30 ou 37°C, mais la vitesse de la réaction ne sera pas la même.... Pour trouver cette quantité d'enzyme, je dois faire une cinétique à 30°C et non à 25 ou 37...

Fouillons encore un peu ces problématiques: On en a rarement l'occasion.

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Jean-Louis :

Bonjour à tous, L'ambiguïté dans la définition du katal soulève bien des problèmes. En effet, si tout le monde est à peu près d'accord pour définir l'activité enzymatique comme une potentialité catalytique et la vitesse enzymatique comme une mesure expérimentale, c'est l'expression en katal qui provoque des divergences. Si l'on regarde un référentiel d'unités légales, on trouve l'équivalence katal = mol/s et si l'on s'en tient à cela, on traduit en katal la valeur de Vm. Définir le katal comme la quantité d'enzyme qui catalyse une mole de substrat par seconde dans des conditions opératoires précises a été au moins au départ une tentative de simplification pour en finir avec des mesures d'unités spécifiques à chaque enzyme. Je pense que dans l'esprit, il s'agissait de Vm pour une température donnée et standardisée mais le standard n'est pas le même pour tous… Et puis, il y a l'utilisation de chaque jour. Pensons à la biochimie clinique : la lecture des coffrets enzymatiques montre qu'ils utilisent souvent des couplages enzymatiques les auteurs préviennent que les conditions opératoires ne permettent pas toujours d'être à la Vmax le sérum est un milieu biologique complexe où l'on trouve en quantité non définie des isoenzymes, des formes multiples circulantes, des substrats, des inhibiteurs…Entre un sérum de contrôle et un sérum pathologique les conditions opératoires sont certainement très différentes ; Malgré tout cela, les résultats sont exprimés en U ou en katal et servent de référence clinique. Imaginons que l'euro soit défini comme la quantité d'argent susceptible d'acheter deux baguettes par jour dans des conditions économiques définies. Tant que ces conditions économiques ne seront pas trop différentes, chacun traduira 1 baguette = 0,5 euro. Ce que je veux dire par là, c'est que traduire en katal une mesure de Vm, voire approchée, n'est peut être pas vraiment un non sens Par ailleurs, ne serait-il pas plus simple de commercialiser les enzymes en euro par unité de masse plutôt qu'en euro/katal. Comme notre collègue l'a bien montré de toute façon il choisit de prendre 25 U par expérience antérieure plus que par calcul. Par contre, pédagogiquement il est certainement intéressant lors de la présentation des activités spécifiques et spécifiques molaires de montrer la différence entre activité enzymatique et mesure expérimentale de la vitesse qui la caractérise. Devant ce problème, chacun y va de son interprétation et propose ses solutions souvent intéressantes mais elles n'auront pas valeur universelle et de toute façon, nous n'aurons pas le pouvoir de lever la contradiction. Ne serait-il pas plus sage de montrer à nos étudiants qu'il y a une ambiguïté et de l'accepter comme telle ? Après tout, il est toujours enrichissant de percevoir les limites de ce que l'on affirme.

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Didier :

Bonjour, Je découvre cette intéressante discussion et je prends le train en marche car mon compte Yahoo s'était trouvé mystérieusement bloqué depuis les vacances. Déjà dans l'Opéron XI 1985 N° 1 E. Mathieu et M. Sanchez avaient essayé de clarifier quelques définitions afin de dégager un consensus pour les examens. C'est sans doute resté lettre morte car depuis, de très nombreux sujets d'examens ont entretenu les confusions.

En fait les concepts utilisés sont récents et ont évolué de façon très importante ces dernières années, il ne me semble donc pas anormal que nous ne nous les sommes pas appropriés, et que nous continuons à colporter un certain nombre d'imprécisions voire d'erreurs. (à ce propos la formule littérale du sujet de bac PAL 2003 annales page 83 est fausse de même que celle de 97 page 74).

Jean faisait référence à un de mes documents (1999) il y a beaucoup d'erreurs dans cette version, une version améliorée (2002/2003) est disponible sur http://webbioch.net mais il y a encore des choses à revoir !!!

Pour ce qui me concerne il me semble important d'intégrer les recommandations internationales actuelles et de ne pas continuer à utiliser des concepts obsolètes et flous.

Cela mériterait un gros travail pédagogique mais le temps comme certaines unités n’est pas extensible ...

Quelques idées qui me semblent fondamentales :

La vitesse : v = d[A]/dt c'est une variation de concentration par unité de temps donc mol.L-1.s-1 (c'est la définition de l'IUPAC depuis 1979/80 -grandeur intensive qui ne double pas quand le système de référence double –comme une température, une concentration- !) c'est la vitesse volumique des nouveaux programmes de chimie. (Rate of reaction)

Auparavant l’IUPAC définissait la vitesse comme une variation de quantité de matière par unité de temps (x avec un point dessus = dx/dt = dnA/dt ) (il s’agit d’une grandeur extensive qui double quand le système double –comme une masse ou un volume- et pas du tout adaptée à l’enzymologie –dixit l’IUPAC). (Rate of conversion) -à traduire par vitesse de transformation (?) en mol.s-1

Vitesse maximum : V ou Vmax (et pas Vm) Constante de Michaelis Km ou KM (je préfère pour le nom propre).

L’historique de katal et d’activité catalytique est intéressante, je mettrai prochainement en ligne un article du Prof. Metais de 1980 sur cela –mais il faut que je le retape complètement...-

Activité catalytique : z unité katal : propriété d’une enzyme mesurée par l’augmentation de la vitesse de transformation (Rate of conversion) de la réaction considérée dans un système défini. Le katal vient (1999/2000) d’être ajouté (cela faisait 30 ans que les biochimistes le réclamaient) dans le tableau 3 des unités SI dérivées. Cf. http://www.iupac.org/publications/pac/2001/pdf/7306x0927.pdf Et http://www1.bipm.org/utils/en/si-supplement2000.pdf

(cette activité catalytique dépend des conditions de la mesure (température, concentrations ...), il n’est donc pas possible de passer, par un coefficient, de la méthode suisse à la méthode allemande).

L’activité catalytique est conceptuellement différente d’une vitesse même si elle s’exprime par une vitesse, c’est une grandeur extensive qui double quand le système double, c’est une grandeur dérivée, équidimentionnelle avec la vitesse de transformation (quantité de matière par unité de temps). Le katal est donc équivalent († ou = avec un chapeau ^ au dessus ) et non pas égal (=) à des mol.s-1 même si c’est difficile à comprendre pour nos élève il ne faut pas confondre (même chose pour masse et poids ...).

Plutôt que “quantité d’enzyme qui transforme une mole de S par seconde” je préfère pour des raisons pédagogiques dire “quantité catalytique (katal)” en effet cette quantité varie avec les conditions (température, pH,...) alors que la quantité d’enzyme (mol.L-1) ne varie pas.

Enfin, et je vais m’arrêter : concentration d’activité catalytique (b en kata.L-1) ou catc activité catalytique molaire zm en kat.mol-1 ou s-1 (à éviter : activité enzymatique molaire ; activité molaire spécifique) activité catalytique spécifique zsp kat.kg-1

Voici quelques liens de références pour les données figurant ci-dessus (malheureusement en anglais) : International Union of Biochemistry and molecular biology http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/ voir enzymes kinetics http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/kinetics/ en particulier le paragraphe 2.2 rate of reaction et l’addendum 1 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/kinetics/ek7.html#p12 enzyme activity et résumé of recommended symbols and units

Voir aussi dans le glossaire : rate of reaction (v); rate of conversion (dx/dt) ; extent of reaction (x ksi) c’est l’avancement noté x ou x en chimie au Lycée http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/gtpoc/

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Jean-Pierre :

Il faut absolument pousser encore cette discussion et essayer d'harmoniser nos enseignements ...

Deux questions à Didier :

1- Faut-il parler de b (catc?), zm et zsp à nos étudiants?

2- Si j'ai bien compris, tu nous demandes de ne pas définir le katal comme étant "la quantité d'enzyme qui transforme une mole de substrat par seconde dans des conditions opératoires parfaitement définies"

mais de le définir comme étant

"la quantité catalytique qui transforme une mole de S par seconde"

sans préciser les conditions. Est-ce bien cela?

C'est de la plus grande importance.

Par exemple dans une expérience classique d'étude de l'influence de la température sur la vitesse des réactions enzymatiques (je n'écris volontairement pas "sur l'activité des enzymes" vu l'ambiguïté du terme activité…), on prépare une série de tubes identiques mais placés à des températures différentes (même volume de substrat tamponné et même volume d'enzyme ajouté pour déclencher la réaction),

- avec la première définition, il y a le même nombre de katals partout;

- avec la seconde, le nombre de katal augmente jusqu'à la température optimale puis diminue ensuite...

Il faut bien qu'on s'entende là dessus dans l'intérêt de nos étudiants...

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Didier Hirou :

1- Faut-il parler de b (catc?), zm et zsp à nos étudiants?

c'est ce que j'utilise depuis de nombreuses années (cf mon poly terminale où il subsiste encore quelques imprécisions que je vais essayer de corriger quand j'aurais l'esprit plus clair...) http://webbioch.net/modules/mydownloads/singlefile.php?lid=4 )

2- Si j'ai bien compris, tu nous demandes de ne pas définir le katal comme étant "la quantité d'enzyme qui transforme une mole de substrat par seconde dans des conditions opératoires parfaitement définies" mais de le définir comme étant "la quantité catalytique qui transforme une mole de S par seconde" sans préciser les conditions. Est-ce bien cela? C'est de la plus grande importance.]

Je ne demande rien du tout ...:-) et je me suis mal exprimé en voulant faire court, au contraire il est essentiel de préciser les conditions de la mesure (exemple méthode SFBC ...), la définition du katal implique que "le mesurande soit spécifié en faisant référence au mode opératoire de mesure ; le mode opératoire de mesure doit mentionner le produit indicateur de réaction mesurée" http://www1.bipm.org/utils/en/pdf/si-supplement2000.pdf page 5 et http://www.iupac.org/publications/pac/2001/pdf/7306x0927.pdf

Je préfére utiliser les termes de "quantité catalytique" plutôt que "quantité d'enzyme" car ce n'est pas la quantité d'enzyme que l'on mesure (au sens de quantité de substance (qs en mole) ou quantité de masse (qm en kg) mais une "abilité catalytique" qui change selon les conditions de la mesure (elles doivent donc bien être précisées) alors que la quantité d'enzyme est constante (en masse comme en mole) quelles que soient les conditions de mesure -température, nature du substrat, concentrations, activateurs, anti inhibiteurs, ....) Il en est de même avec "concentration catalytique" plutôt que "concentration en enzyme". C'est uniquement une nuance d'ordre pédagogique car la littérature y compris dans la commission de normalisation utilise l'un ou l'autre.

Il me semble important de préciser que ces grandeurs se rapportent non pas au système de mesure (échantillon dilué dans un mélange réactionnel indispensable à la mesure elle-même qui permet de mesurer Vmax) mais à l'échantillon lui-même (plasma, extrait tissulaire ...) Vmax n'est donc pas la concentration catalytique c'est une grandeur qui lui est proportionnelle. Il y a lieu aussi de tenir compte des dilutions entraînées par d'éventuels réactifs d'arrêt et/ou de colorimétrie. Enfin, il me semble incorrect (et de nature à troubler inutilement les élèves -c'est déjà bien assez compliqué-) d'exprimer une vitesse en katal.L-1 ou une concentration d'activité catalytique en mol.L-1.s-1 comme cela se voit souvent, cela serait bien si les sujets d'examen faisaient preuve de rigueur à ce niveau et si les grandeurs dérivées demandées respectaient les recommandations édictées dans les années 80 quant à leur appelation.

J'arrête là mes divagations.

Valley http://webbioch.net http://ww2.ac-poitiers.fr/biotec/bp/

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Marianne :

Bonjour à tous et bienvenue dans le texte ci-dessous pour un regard externe, et j'espère éclairant, sur nos questions d'enzymologie:

Considérons le Chinatown parisien, dans le 13ième, avec ses hauts immeubles d'une quinzaine d'étages. Beaucoup de gens travaillent au noir, enfermés dans des appartements, ils font pour la plupart de la confection. Imaginez-vous dans la peau d'un inspecteur du travail. Vous voulez évaluer le nombre de personnes cachées (souvent séquestrées) dans ces appartements. Vous travaillez devant un de ces immeubles.

Sachant que la présence de ces travailleurs se manifeste par la confection de robes, vous pouvez exploiter la manifestation de leur présence-objective et mesurable-en comptant combien de vêtements sortent par jour de l'immeuble. C'est de l'expérimentation. Vous en comptez par exemple 80. Estimant qu'une personne réalise 10 robes par jour (vous choisissez arbitrairement une unité-travailleur), vous êtes à même alors de convertir la vitesse de sortie des vêtements en une quantité de travailleurs dans l'immeuble. Vous calculerez qu'il y a 8 unités-travailleurs (AE). Vous constatez ici que vitesse de sortie de l'immeuble et quantité de travailleurs ont des valeurs et des unités différentes. C'est normal, ce n'est pas du tout la même chose: vous ne vous imagineriez pas dire que la quantité de travailleurs est de 8 robes par jour. Il vous est donc tout à fait impossible d'exprimer une quantité d'enzyme en mol/s.

Vous aurez remarqué, grâce à votre longue expérience de contrôle du travail que l'activité des travailleurs dépend de leurs conditions de travail. Vous aurez ainsi noté qu'il y a a apparemment plus de travailleurs quand il fait bon (moins quand il gèle) et qu'il y a également apparemment plus de travailleurs quand les prix alimentaires baissent. Pour pouvoir comparer vos résultats, vous déciderez probablement de fixer les conditions de vos mesures à une certaine température et dans un certain environnement économique du milieu: c'est la standardisation. Si vous souhaitez obtenir de fortes valeurs (probablement plus sûres), vous choisirez des mesures dans de bonnes conditions de travail: c'est l'optimisation.

Enfin, en liaison avec vos collègues dans d'autres pays, vous pourriez vous intéresser à l'évaluation du traffic de ces esclaves. Vous voudriez alors connaître combien de ces boat-people étaient présents dans le bateau qui les transportait. Imaginons, bien que cette image soit fort peu crédible!, que vous sachiez que les travailleurs de l'immeuble viennent de 10% du fameux bateau. Le bateau faisait 100 m3, vous avez étudié 10m3 et trouvé 8 travailleurs. Il y avait donc une concentration de travailleurs dans le bateau de 8/10=0.8 travailleur par m3 de bateau (CAC par litre déchantillon d'enzyme). Et le bateau transportait en tout 80 travailleurs (AT =activité totale) Puisqu'on parle de concentration, vous pouvez anecdotiquement calculer la vi dans l'immeuble. Si l'immeuble fait 8 000 m3, la vi vaut 80/8000= 0.01 robes par jour et par m3 d'immeuble (Vi exprimée par litre de milieu réactionnel). Ici vi= 0.01 robes par jour et par m3 d'immeuble et CAC=0.8 travailleur par m3 de bateau , on voit de nouveau que ni les valeurs, ni les unités ne sont les mêmes. C'est normal: on ne parle pas de la même chose. Pour répondre à la remarque de Jean-Louis sur la Vm, je voudrais confirmer qu'une détermination d'AE ne se fait pas forcément à Vm, notamment dans les réactions couplées, comme il le mentionne et de façon générale pour des motifs économiques (prix d'un cosubstrat saturant par exemple). Il ne faut donc pas confondre AE et AE optimisée et ne pas "traduire katal en Vm" (ce qui de toute façon est un non-sens, comme la comparaison du nombre d'équivalents-travailleurs dans l'appartement et de la vi le montre). Même si le calcul du nombre de travailleurs dépend de la mesure de leur vitesse de travail (et de la définition d'unité arbitrairement choisie), ce sont deux choses qui ne peuvent être traduites-au sens littéral de traduction- l'une en l'autre car elles n'ont pas la même signification.

Pour conclure, il est effectivement difficile de conjuguer toutes ces unités et de toujours arriver à se représenter ce dont on parle; toute illustration faisant appel à des domaines différents porte ses propres limites, vous ne manquerez pas d'en trouver dans l'exemple que j'ai choisi (notamment une discussion tardive sur l'extensivité de certaines valeurs) en tout cas nous avons au moins un avantage avec les enzymes: c'est nous qui leur donnons leur permis de séjour!

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Didier :

Les moines copistes qui travaillent pour webbioch.net ont terminé leur travail et l’article du Professeur Metais auquel j’ai fait référence dans une précédente intervention est disponible dans les téléchargement catégorie articles à l’adresse suivante : http://webbioch.net/modules/mydownloads/visit.php?lid=178.
Pour des raisons de temps les enluminures seront réalisées plus tard ... Bonne lecture

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Jean-Noël :

Il a été écrit dans différents msg concernant l'enzymologie, que l'activité enzymatique n'était pas toujours mesurée à Vmax, en particulier pour les réactions couplées : je ne comprends pas la remarque puisque la vitesse mesurée est celle de la réaction limitante qui est évidemment celle que l'on cherche. Il faut simplement que la réaction couplée soit plus rapide (et elle ne sera jamais alors dans des conditions de Vmax car la solution la plus simple est un excès d'enzyme).

Pouvez-vous m'éclairer , et sûrement qq autres !, sur ce point ?