Enzymologie et unités (fin 2010)
Marianne GENTHON
Bonjour tout le monde et Elisabeth!
J'ai à mon tour identifié par une lettre les sous paragraphes de ton deuxième point au sein de ton message :-)
* pour utiliser l'équation de Michaelis (et pour la démontrer d'ailleurs) il faut être en phase stationnaire: S>>P et avoir S>>E. Dans ces conditions on assimilera S à un instant t quelconque de cette période à S initial ce qui est bien pratique. Dans les conditions michaeliennes le % en enzyme active est déterminé par S/(Km+S) et cela seulement. Si S est fixe le % ne varie pas, si le stock de tissu est constant le % de travailleur clandestin au travail est le même, c'est la base même des dosages d'enzymes!
Il est tout à fait courant que le catalyseur soit 10 000 fois moins concentré que les plus petites concentrations en S utilisable expérimentalement (donc détectables).
Bon ça c'était pour enfoncer le clou "classique" et je crois qu'on est d'accord (points A, B, C, D, E) et que c'est LA chose à transmettre aux élèves
* dans les conditions de dosage d'enzyme (S fixe j'insiste;-)) si vi est plus faible alors c'est que tu as encore moins de risque d'avoir E>S non? D'autre part si E est plus faible la phase stationnaire dure plus longtemps. Du coup je ne suis pas sûre d'avoir compris toutes les subtilités de tes points "G" et "H" en tous cas dans les dosages classiques.
* s'il existe des dosages officiels de substrats hors phase stationnaire, on en parle moins pour les dosages d'enzyme. Toutes les remarques que j'ai pu faire sur Michaelis supposent évidemment que je me plaçais en situation.... michaelienne donc en phase stationnaire et je crois qu'on peut être bienheureux quand ce seul et simple aspect est passé auprès des élèves!
Essayons d'examiner néanmoins ce qui te torture (point I): on ne peut pas modéliser théoriquement les situations non michaeliennes de sortie de phase stationnaire? Si, certainement, mais on se traîne des équations énormes. Est-ce utile? Pour notre satisfaction intellectuelle bien sûr, dans la pratique non.
Il suffit d'établir empiriquement des conditions expérimentales permettant d'obtenir une bonne zone de linéarité et de faire le dosage uniquement dans cette zone (comme tous les dosages évidemment y compris ceux faits en situation michaelienne). Les dosages de S par la méthode deux points hors phase stationnaire sont longs à mettre au point mais parfaitement utilisables à l'intérieur des conditions expérimentales requises. Les dosages d'enzymes en unités arbitraires idem. Pour changer de domaine, a-t-on besoin de savoir que deux molécules de colorants "ninhydrine"sont consommées pour un acide aminé pour construire et utiliser une gamme d'étalonnage destinée à doser l'acide aminé?.
Les zones de linéarité sont fournies avec les kits de dosage, parfois des procédures particulières y font référence ("si deltaA par min >x diluer l'échantillon et recommencer" par exemple) cela pour suggérer un élément de réponse à ton point F. Dans le contrôle de qualité si des défauts apparaissent dans une méthode deux points il faudra en effet chercher à savoir si le temps imposé est sorti de la phase stationnaire (thermostat ou chronomètre déréglés par exemple). Ce problème est par contre directement visualisé en méthode continue.
Je pense que le plus compliqué dans la mise au point d'une méthode de dosage d'enzyme relève plus de la recherche des interférences dans les milieux biologiques que de la mise en évidence de la zone de linéarité du dosage ou de la recherche de la durée de la phase stationnaire
Autre point de contrariété: on ne peut parfois pas utiliser des katals. Le katal étant une convention, utiliser des unités relevant d'une autre convention n'empêche pas du tout de suivre une purification, de calculer des rendements et taux de purif, de suivre des variations de taux en milieu naturel, de soigner les gens, de contrôler des produits alimentaires, des enzymes commerciales comme les enzymes de restriction etc. On peut tout faire si on a validé une gamme d'étalonnage...sauf calculer une activité molaire assimilable à k2.. Bon évidemment malgré mes petites provocations, je suis bien d'accord qu'il faut commencer par les katals avec les élèves ;-)
Tes réflexions sur la durée de la phase stationnaire, que je trouve fondamentales, me donnent envie de préciser que lorsque nous-mêmes mettons au point un Tp de détermination de Vm et Km nous devons avoir validé que le temps au bout duquel on arrête la réaction est situé pendant la phase stationnaire de tous les tubes (toutes les concentrations en substrat testées). Cela revient essentiellement à vérifier la durée pour le tube dans lequel S est le moins concentré (phase stationnaire la plus courte) et à prendre un temps d'arrêt valable pour ce tube et donc pour tous les autres. Si cette phase stationnaire nous parait un peu trop courte pour que les élèves aient le temps de manipuler on peut l'allonger ...en diluant l'enzyme!
Jean-LUC PRUVOST
Désolé du silence, il fallait que je dispose d'un temps suffisant pour cristalliser ma pensée. Comme le dit Marianne le problème est que:
- on ne connaît pas exactement la stœchiométrie
- le substrat lui-même est polymorphe (plusieurs molécules de masses moléculaires variées).
En se limitant à l'amylose (c'est déjà assez complexe) :
Pour la réaction, on ne peut pas utiliser
(glc)n + H2O -> (glc)n-1 + glc c'est évidemment faux.
(glc)n + (n-1) H2O -> n (glc) est tout aussi faux
(glc)n + (n-1)/2 H2O -> n/2 (mal) est un peu mieux mais ne tient pas compte du maltotriose
(glc)n + y H2O -> a Mal + (n-a) maltotriose serait utilisable à condition de
- connaître
- et doser séparément les deux produits pour connaître la quantité de substrat consommé
Bref déterminer une activité catalytique en utilisant le katal selon les préconisations rappelées (euh euh...) dans le cas de l'hydrolyse d'un polycondensat (ou polymère, ici) est une tâche quasi impossible sans informations très poussées, et qui va sans doute dépendre de l'espèce qui a produit l'enzyme.
Voici mes conclusions (et donc l'objet de ma question).
Marianne et Elisabeth proposent les UA. Effectectivement cela semble la réponse raisonnable, mais aussi un réel constat d'échec dans cette volonté d'uniformiser la notion d'activité catalytique.
Une piste cependant : considérer que le substrat n'est pas l'amidon mais la liaison osidique alpha 1-4 entre glc, ce qui revient au coefficient près à utiliser la deuxième équation-bilan citée.
Pour le sujet : je ne l'ai pas sous les yeux, et comme je n'ai pas participé à l'évaluation cette année...