Enzymologie et unités (fin 2010)
Élisabeth MATHIEU
Merci, Jean-Luc, d'avoir bien explicité ta question et tes interrogations.
J'ai été regardé dans diverses sources les méthodes de dosage de l'alpha-amylase qui peuvent être employées.
- Dans Worthington Manual Enzymes (ancien, 1988, mais qui reste une mine d'informations), ils parlent de suivi par mesure du pouvoir réducteur à la méthode au 3,5-DNS.
- Dans Biochemica information de Boehringer Mannheim, ils parlent aussi de se rapporter en équivalent réducteur ou bien d'utiliser le maltotétaose ou maltoheptaose et méthode UV avec le NADH, ou méthode colorimétrique avec le substrat 4-nitrophénylheptaoside.
- Chez BioMérieux, ils utilisent aussi ces 2 dernières méthodes soit :
1ère méthode :
1) maltotétraose + H2O ---- 2 maltose (alpha-amylase)
2) maltose + Pi ----- béta-1-phosphoglucose (maltose phosphorylase)
3) béta-1-phosphoglucose ------ 6-phosphoglc (béta-phosphoglucomutase)
4) G6P + NAD+ + H2O ---- 6-phospho gluconate + NADH + H+ (6-phosphoglucose deshydrogénase)
Dans ce cas, à partir d'un maltotétraose, il se forme 2 NADH, la stoechiométrie est connue (bien sûr, il faut que ce soit la vitesse de la réaction 1) qui soit la vitesse limitante) et on peut parfaitement définir l'activité catalytique de l'alpha-amylase et l'exprimer en katal à partir du suivi de NADH et faire intervenir le coeff 2 dans la définition de l'activité.
Le résultat sera bien exprimé en katal, mais il faudra impérativement dire les conditions du système d'essai, dont le nom de substrat : maltotétraose, ainsi que la méthode de dosage.
ou, autre méthode,
1) Benz-G7 4-NP + H2O ----- Benz-G(7-n) + Gn 4-NP (alpha-amylase)
2) Gn 4-NP + n H2O ----- n Glc + 4-nitrophénol (Glucoamylase, alpha-glucosidase)
Dans ce cas, on suit l'apparition du 4-nitrophénol à partir du substrat 4-nitrophénylmaltoheptaoside protégé par le groupement Benzylidène à l'extrémité non réductrice. La stoechiométrie est connue (1 S consommé, 1 4-NP formé) et l'activité catalytique peut être exprimée en katal. Là encore, le résultat sera rendu en indiquant le nom du substrat et la méthode de dosage.
- Si on utilise une méthode où la stœchiométrie ne peut pas être connue, comme dans tes exemples, ce que je propose n'est pas exactement de parler de UA, car, - et pour cela, je suis d'accord avec toi, ne pouvant s'harmoniser avec les définitions officielles, je trouve qu'il ne faut pas employer de sigles hermétiques ! - Je parlerais plutôt d'unité arbitraire, en définissant cette unité arbitraire comme la quantité d'alpha-amylase qui catalyse la formation d'une mole d'équivalent réducteur s-1 (si c'est cela que l'on dose), ou d'une mole de Glc (si on est sûr de doser le Glc vrai et non pas un mélange de maltose et Glucose) ou d'une mole d'équivalent maltose s-1, si on préfère se ramener à une molécule précise. Là encore, le résultat sera obligatoirement rendu en indiquant le nom du substrat et la méthode. Une activité catalytique est définie dans un système d'essai déterminé qu'il faut toujours indiquer.
Dans ce cas bien sûr, on ne pourra pas parler de katal, mais on saura clairement de quoi on parle, et on évitera aussi de mettre le temps en minute !
Voilà comment j'aurais tendance à résoudre le problème, et c'est bien cela que font la plupart des labos ou des fabricants quand ils nous donnent des informations sur les étiquettes ou les valeurs attendues. Pour moi, ce n'est pas vraiment un constat d'échec, de ne pouvoir mettre tous les cas dans le même panier ... Il reste toujours des exceptions, et on essaye d'être le plus clair possible, c'est à dire, on doit toujours savoir exactement dans quelles conditions ont été obtenues ces activités catalytiques. Par contre, il est évidemment dommage que les fabricants n'expriment pas en katal quand la méthode qu'ils utilisent présente une stœchiométrie parfaitement connue ...
Et pour nous, cela n'empêche pas de respecter les définitions officielles et sur lesquelles la communauté internationale s'est mise d'accord, toutes les fois que cela est possible.
Êtes vous d'accord avec tout cela ?
A bientôt la suite !
Jean-LUC PRUVOST
Oui effectivement, avec un un tétraholoside, si l'amylase coupe bien systématiquement au milieu, ça semble bien rigoureux.
Pour les unités arbitraires, bien sûr que cela doit être défini !
Dans tous ces cas, il faudra néanmoins pouvoir définir un système de conversion pour le dimensionnement car industriellement à partir de la concentration catalytique on va devoir définir la quantité de solution enzymatique pour l'hydrolyse d'amidon, substrat d'intérêt.
C'est très intéressant, merci.
Élisabeth MATHIEU
Bonjour Marianne, Jean-Luc et tout le monde !
Merci de ces échanges vraiment très intéressants. Cela fait du bien de voir que nous sommes tout à fait sur la même longueur d'onde pour toutes les explications théoriques ! Et que les questions que nous nous posons sont partagées, et résolues de façon bien semblable. Nous insistons aussi de la même façon auprès des élèves sur tous les points essentiels (par exemple, je fais faire aux élèves exactement comme toi pour la durée de la période stationnaire). Mais c'est bien de se le dire, car évidemment, si je suis entièrement d'accord avec le fait qu'une relation, si elle est prouvée expérimentalement, on peut l'appliquer, il n'en demeure pas moins que je préfère contrôler par la théorie ce que l'on applique empiriquement. En effet, quand on ne travaille pas avec un kit (et c'est très fréquent pour nous, ainsi que pour nos étudiants lors de leur stage, c'est à eux de mettre au point des méthodes de détermination d'activité catalytique), je trouve que la pratique doit être étayée par la théorie car quand on veut que ce soit linéaire .... on peut toujours accepter des coefficients de corrélation qui ne sont pas géniaux ... les méthodes de mesure ne sont pas toujours évidentes .. donc il vaut mieux savoir où on va et garder à l'esprit tout ce qu'il faut respecter !
Donc cela m'a vraiment intéressé de partager ces explications avec vous. Et la question posée par Jean-Luc du passage au pilote et à l'échelle industrielle est tout à fait pertinente ! Là encore, empirisme, essais expérimentaux, mais aide avec la théorie ! Il faut tout !!
Merci beaucoup et à bientôt ! A certains moments, ce serait bien de se parler directement par oral